Инфекционные заболевания, вызываемые вирусными и бактериальными патогенами, являются серьезной проблемой в животноводстве и приводят к значительным экономическим потерям (Swayne, 2013; Vanderwaal and Deen, 2018; Shurson et al., 2022).
В настоящее время наиболее распространенным и экономически эффективным способом борьбы с различными заболеваниями в животноводстве является использование антибактериальных препаратов. В условиях растущего спроса на мясо и другую продукцию животноводства, обеспечение ветеринарной безопасности является критически важным фактором, из-за чего необходимость в использовании антибиотиков только усиливается, благодаря их дешевизне и эффективному действию (Van Boeckel et al., 2015).
Наряду с этим, антибактериальные препараты так же используются в роли ростостимулирующих агентов (Butaye et al., 2003).
Однако учащаются случаи возникновения антибактериальной резистентности у патогенных микроорганизмов, что в некоторых странах привело к запрету или строгому ограничению использования антибиотиков в животноводстве (Davies et al., 2019; Maron et al., 2013). При этом необходимость в препаратах столь же эффективных, как и антибиотики, является острой потребностью отрасли.
Наряду с этим, большой популярностью пользуется применение в кормах органических кислот. Они снижают рН желудка, подавляют патогенные бактерии, повышают переваримость питательных веществ и улучшают показатели роста (Suryanarayana et al., 2012). Органические кислоты также способствуют выделению пищеварительных ферментов, увеличивают время удержания корма в кишечнике и положительно влияют на качество мяса, не оставляя химических остатков (Rathnayake et al., 2021). Их эффективность зависит от типа и концентрации используемых кислот, фазы роста животного, состояния здоровья и факторов окружающей среды (Rathnayake et al., 2021).
Органические кислоты в недиссоциированной форме способны проникать в микробную клетку. Попадая в клетку, кислота вступает в реакцию с щелочной средой клетки, что приводит к снижению внутриклеточного pH. Это влияет на микробный метаболизм, ингибируя действие важных микробных ферментов, и заставляет бактериальную клетку тратить энергию на высвобождение протонов, что приводит к внутриклеточному накоплению анионов кислоты, благодаря чему нарушается жизнеспособность микроорганизма и оказывается антимикробный эффект (Schutte 2011). Однако грамотрицательные бактерии способны метаболизировать длинно- и короткоцепочечные органические кислоты. При этом наибольшая эффективность действия органических кислот достигается в кислой среде желудка (Hinton et al., 2000).
Как правило, молочнокислые бактерии способны расти при относительно низком pH, что означает, что они могут переносить большую концентрацию органических кислот, чем другие виды бактерий, например, E. coli. Объяснить это можно тем, что грамположительные бактерии имеют высокую внутриклеточную концентрацию калия, который обеспечивает противодействие анионам кислоты (Russell & Diez-Gonzalez, 1998).
Общие свойства моноглицеридов
Однако уже сейчас существуют добавки, значительно более эффективные чем органические кислоты – моноглицериды. Моноглицериды встречаются в природе и содержатся в грудном молоке млекопитающих, кокосовом масле и в виде участников углеводного обмена.
Моноглицериды образуются путем связывания короткоцепочечных жирных кислот (КЖК/SCFA) и среднецепочечных жирных кислот (СЖК/MCFA) с глицерином в процессе этерификации. Ковалентная связь между кислотой и молекулой глицерина активизирует жирную кислоту независимо от рН среды (Nitbani еt al., 2020).
При этом моноглицериды сохраняют свойства жирных кислот – короткоцепочечные моноглицериды проявляют большую эффективность в отношении грамотрицательных микроорганизмов, а среднецепочечные – в отношении грамположительных.
Помимо этого, по месту присоединения жирной кислоты выделяют 1-моноглицериды, так же известные как альфа – моноглицериды, и 2-моноглицериды, так же известные как бета – моноглицериды. 1-моноглицериды обладают значительно более выраженным антибактериальным действием в сравнении с 2-моноглицеридами (Nurmala et al., 2018).
При этом моноглицериды участвуют в процессе липидного метаболизма в организме (образуются при расщеплении триглицеридов), за счет чего не оказывают негативного ненаправленного воздействия - при переваривании, триглицериды (в том числе трилаурин) абсорбируются в виде 2-моноглицеридов и свободных жирных кислот после того, как жир эмульгируется и гидролизуется в процессе переваривания. Переваривание жира начинается с воздействия на него лингвальной и желудочной липазы, которые не нуждаются в присутствии желчных солей. Переваривание жира продолжается в двенадцатиперстной кишке, где образуются мицеллы. Под воздействием панкреатической липазы в жировых каплях происходит гидролиз триглицеридов с разрывом связей в позициях sn–1 и sn–3 и образованием свободных жирных кислот и 2-моноглицеридов. Далее желчь эмульгирует жир, что является необходимым этапом образования мицелл.
Колипаза, которая синтезируется поджелудочной железой, способствует перемещению свободных жирных кислот и 2-моноглицеридов из жировой капли в мицеллы.
Всасывание жиров в стенку кишки происходит в большей степени путем пассивной диффузии жирных кислот и 2-моноглицеридов. После всасывания в энтероциты 2-моноглицериды и свободные жирные кислоты реэтерифицируются с помощью специфических 2-моноглицерид ацилтрансфераз в триглицериды, которые включаются в хиломикроны для их системного распределения.
В результате переваривания жира в организме образуются 2-монолглицериды, которые не обладают какой-либо антибактериальной активностью. 2-моноглицериды в любом случае будут усваиваться как жир и не будут обладать каким-либо эффектом кроме обеспечения организма энергией.
Метаболизм 1-моноглицеридов осуществляется иначе. В просвете кишечника липазы не распознают альфа-моноглицериды как субстрат, то есть не способны разрушить связь между глицерином и кислотой в позиции sn-1, а после всасывания в энтероциты 1(3)-моноглицериды почти не распознаются как субстрат ацилтрансферазы, по этой причине моноглицериды большей частью перенаправляются в портальную вену и циркулируют в токе крови, пока не будут подвергнуты β-окислению (как и свободные жирные кислоты) в различных тканях.
Следует также отметить то, что на их эффективность не влияют изменения кислотности среды желудочно-кишечного тракта (Tamboli et al., 1983). Моноглицериды могут оказывать как бактериостатическое, так и бактерицидное действие, при этом выраженная эффективность проявляется в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий, оболочечных вирусов. Также ряд исследований говорит о наличии иммуномодулирующих свойств (Jackman et al., 2020).
Такой набор свойств потенциально позволяет эффективно заменить моноглицеридами антибактериальные стимуляторы роста без сопутствующего риска развития антибиотикорезистентности у патогенных микроорганизмов.
В целом, механизм антибактериального действия различных форм моноглицеридов схож – особенность их бактерицидного действия заключается в том, что, попадая в печень, они не расщепляются, благодаря чему длительное время сохраняют свою активность, а легкая проницаемость в патогенные микроорганизмы обеспечивается молекулой глицерина, которую микроорганизмы воспринимают как питательный субстрат. При расщеплении моноглицерида в клетке резко падает кислотность, в результате чего парализуется жизнедеятельность микроорганизма (Jackman et al., 2022).
Моноглицериды действуют на протяжении всего ЖКТ, могут проникать в кровь и лимфу, а также молоко (Song et al., 2021).
Механизм антибактериального действия
Механизм антибактериальной активности жирных кислот и моноглицеридов был изучен с помощью различных экспериментальных методов, что позволило установить, что они в основном нацелены на мембраны бактериальных клеток и прерывают важнейшие процессы, участвующие в защите и функционировании клеток. Способность к разрушению мембран жирных кислот и моноглицеридов обусловлено их гидрофильными и гидрофобными свойствами, приводящими к наложению друг на друга ряда явлений, включая дестабилизацию мембраны и образование пор (Yoon et al., 2018).
Дестабилизирующая мембрану активность вызывает повышение проницаемости клеток и их разрушение, что приводит к подавлению роста бактериальных клеток (бактериостатическое действие) или к их гибели (бактерицидное действие). Среди жизненно важных процессов, протекающих в мембранах бактериальных клеток, два наиболее важных связаны с дыхательной цепью и накоплением энергии в клетке, которые необходимы для производства энергии в бактериальных клетках. Эти два процесса взаимосвязаны, и жирные кислоты способны нарушать процесс электронно-транспортной цепи, связываясь с переносчиками электронов или изменяя целостность мембраны, а также препятствовать накоплению энергии в клетке, снижая мембранный потенциал и нарушая транспорт протонов водорода внутрь и из клетки (протонный градиент). Более того, жирные кислоты могут напрямую ингибировать мембранные ферменты, такие как глюкозилтрансфераза, а также воздействовать на другие мембрано-ассоциированные белки (Kurihara et al., 1999; Won et al., 2007).
В целом можно выделить несколько основных аспектов антибактериального действия моноглицеридов:
- увеличение проницаемости мембраны и разрушение клетки;
- нарушение цепи переноса электронов и отключение накопления энергии в клетке;
- ингибирование ферментативной активности мембраны и поглощения питательных веществ.
Электронно-транспортная цепь и АТФ-синтаза расположены на внутренней мембране грамположительных и грамотрицательных бактерий (Boyer et al., 1997). Процесс транспорта электронов сопровождается переносом протонов (H+) из цитоплазмы наружу клетки, создавая градиент протонов через цитоплазматическую мембрану и повышая мембранный потенциал, который обеспечивает источник энергии для производства АТФ через АТФ-синтазу. Когда один из этапов электронно-транспортной цепи и окислительного фосфорилирования прерывается, бактериальным клеткам становится трудно получать достаточно энергии для функционирования, что приводит к торможению роста клеток и, в конечном счете, к их гибели (Yoon et al., 2018).
Так же выявлен и еще один интересный механизм антибактериального действия моноглицеридов – генетический, зависящий от концентрации. Механизм представлен на рисунке:
Моноглицерид сначала пересекает мембрану E. coli в концентрациях, значительно ниже минимальной ингибирующей концентрации (МИК), что является основой антибактериального эффекта. Затем он нацеливается на геномную ДНК и повреждает ее двойную спираль, влияя на синтез РНК и последующий синтез белка и ДНК, вызывая остановку клеточного цикла и, наконец, приводя к нарушению деления клеток (Jian et al., 2018).
Противогрибковое действие
Моноглицериды с хорошими амфифильными свойствами способны не только подавлять рост грибов, но и убивать их, в частности C. albicans и некоторые виды грибов, таких как Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus niger и Penicillium citrinum (Seleem et al., 2018; Jumina et al., 2018).
Существуют две основные цели противогрибковых препаратов:
- взаимодействие с химическими компонентами клеточных стенок грибов, такими как маннаны, глюканы и хитины;
- взаимодействие с несколькими ферментами, отвечающими за биоактивность и путь биосинтеза эргостерола.
Моноглицеридные соединения, такие как монолаурин, мономиристин и монокаприн, монопропионин зарекомендовали себя как противогрибковые средства и действуют по ингибирующему механизму макролидов, в частности полиенов. Ацильная группа липофильной части моноглицеридов взаимодействует через ван-дер-ваальсово взаимодействие с эргостеролом в клеточных стенках грибов и вызывает лизис и гибель клеток. В то же время две гидроксильные группы в моноглицеридах отвечают за противогрибковую активность, образуя водородные связи с другими полярными компонентами клеточной стенки грибов (глюканами, хитинами), способствуя процессу лизиса клеточной мембраны (Nitbani et al., 2020).
Среди наиболее изученных моноглицеридов можно выделить монолаурат (монолаурин) – соединение на основе глицерина и лауриновой кислоты, монопропионат (монопропионин) – соединение на основе глицерина и пропионовой кислоты, и монобутират (монобутирин) – соединение на основе глицерина и масляной кислоты.
Монолаурин
Монолаурин является моноглицеридом лауриновой кислоты. При использовании в кормлении поросят, зараженных вирусной эпидемической диарее свиней, монолаурин увеличил высоту кишечных ворсинок и глубину крипт. При этом у поросят, получавших монолаурин, была снижена вирусная нагрузка и интенсивность воспаления за счет сниженной активности провоспалительного фактора IL-8 (Zhang et al., 2022).
В кормлении бройлеров монолаурин сравнивали с антибактериальным стимулятором роста бацитрацином. В результате выявили, что при использовании бацитрацина снижалась высота ворсинок кишечника и как следствие ухудшался показатель конверсии корма. Монолаурин в свою очередь, стимулировал рост ворсинок и улучшал показатель конверсии корма (Letlole et al., 2021). Так же было обнаружено что применение монолаурина в кормлении бройлеров снижает интенсивность окислительного стресса путем снижения уровня активности прооксидантного фактора - малонового альдегида в печени (Saleh et al., 2021).
Стоит особо выделить, что монолаурин обладает и противовирусной активностью в отношении оболочечных вирусов (Yoon et al., 2018).
Монолаурин является действующим веществом кормовых добавок Мисма ML и Мисма ML40.
Монопропионат и монобутират
Монобутират и монопропионат входят в состав кормовой добавки Мисма БутиПро Л.
Монопропионат представляет собой соединение пропионовой кислоты с молекулой глицерина. Проявляет антибактериальные и противогрибковые свойства и способствует повышению продуктивности цыплят бройлеров: в частности, способствовал улучшению показателя конверсии корма, повышал сохранность и живую массу (Бирюков и др., 2021).
Монобутират продемонстрировал иммуномодулирующий эффект у телят (Masmeijer et al., 2020). В кормлении несушек, использование монобутирата позволило увеличить массу яйца, толщину скорлупы и снизить бой яиц. При этом в кишечнике отмечалось снижение численности энтеробактерий (Feng et al., 2020). Так же отмечается высокая активность монобутирата в регулировании количества Salmonella enteritidis в организме. (Van Driessche et al., 2015). При использовании в кормлении свиней использование монобутирата позволяло повысить показатели привеса и снизить частоту возникновения диареи (Kovanda et al., 2021).
Заключение
Моноглицериды являются следующим шагом на этапе поиска эффективных антимикробиальных препаратов, сохраняя и усиливая сильные стороны органических кислот, но нивелируя их недостатки. При этом из-за особенностей строения молекулы моноглицерида, они могут оказывать широкий спектр действия – антимикробиальный, противогрибковый, и в случае монолаурина - подтвержденный противовирусный эффект в отношении оболочечных вирусов.
Это позволяет повысить технологичность производства – оставить органическим кислотам роль доступных и эффективных подкислителей, а моноглицериды использовать непосредственно в качестве антибактериальных и противогрибковых добавок широкого спектра действия. При этом благодаря широкой вариативности моноглицеридов можно с легкостью подобрать необходимый моноглицерид или их композицию для достижения желаемого эффекта.
Статья подготовлена техническим отделом МИСМА, декабрь 2024г.
